熒光定量PCR分析儀通過實時監(jiān)測熒光信號變化，結合Ct值與標準曲線分析，實現(xiàn)基因的精準定量，其核心原理與實現(xiàn)步驟如下：

　　核心原理

　　在PCR擴增反應體系中加入熒光基團（如SYBRGreen染料或TaqMan探針），使熒光信號強度與擴增產(chǎn)物量同步變化。每完成一個PCR循環(huán)，儀器采集一次熒光信號，生成擴增曲線。通過設定熒光閾值（通常為基線信號的10倍標準差），確定擴增產(chǎn)物達到閾值時的循環(huán)數(shù)（Ct值）。Ct值與起始模板量呈負相關，即起始模板量越多，Ct值越小。

　　實現(xiàn)步驟

　　標準曲線構建：使用已知濃度的標準品（如純化質(zhì)粒DNA或體外轉錄RNA）進行梯度稀釋，以不同濃度的標準品為模板進行PCR擴增。以標準品拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，Ct值為縱坐標繪制標準曲線。當標準品濃度范圍在10²-10¹?拷貝數(shù)時，模板濃度與Ct值通常呈現(xiàn)良好的線性關系（相關系數(shù)R²>0.99），確保在此范圍內(nèi)可準確定量。

　　未知樣本檢測：將未知樣本與標準品同步擴增，根據(jù)其Ct值代入標準曲線公式，計算樣本中目標基因的拷貝數(shù)。例如，若標準曲線公式為y=3.1372x+38.201（y為Ct值，x為拷貝數(shù)對數(shù)），通過反向計算即可得出樣本的初始模板量。

　　內(nèi)參基因校正（相對定量）：在需要比較不同樣本間基因表達差異時，選擇管家基因（如GAPDH、β-actin）作為內(nèi)參，通過計算目標基因與內(nèi)參基因的Ct值差值（ΔCt），進一步采用ΔΔCt法分析相對表達量，消除樣本量及反應效率差異的影響。